10.3 TÉCNICA DE CLONACIÓN DE GENES

Una clona es definida como un gran numero de células o moléculas todas idénticas provenientes de un origen único Clonación del DNA ha sido posible por: Enzimas de restricción.  La capacidad de los vectores de clonación de multiplicarse después  que DNA ha sido insertada en su genoma.

Clonación del DNA

Es la inserción de DNA en un vector de clonación y luego este vector con el DNA debe ser introducido en bacterias o levaduras u otra célula hospedera.

Clonación require:

A. DNA Blanco:

PCR: Primers específicos y purificar el fragmento amplificado

RT-PCR: cDNA y luego primers específicos y purificar el fragmento amplificado.

B. Vectores de Clonación-Expresión: Elementos

Plásmidos, cosmidos, fagos, Bac, Yac, etc.

C. Célula hospedera:

E. coli, levaduras, Células de insectos.

D. Métodos de transformación:

Inefectividad.

Cloruro de calcio, cloruro de litio, liposomas, etc.

Electroporacion, balistica o shot gun.

Método de tamizaje de la presencia del inserto.

- Inicialmente, que la bacetria crezca en presencia del marcador de selección.

- Cambio de coloración de la colonia bacteriana.

- PCR

- Miniprep y digestión con enzimas de restricción.

- Hibridización con una sonda

- Evaluando la expresión o actividad de la proteína.

10.4 PRUEBA DE PCR EN EL DIAGNOSTICO DE                ENFERMEDADES GENÉTICAS POR MICROORGANISMOS  (BACTERIAS, PROTOZOARIOS, ENTRE OTROS)

Las aplicaciones actuales de la biología molecular para el diagnóstico clínico son muy variadas:

Genética

• Diagnóstico prenatal
• Tipaje de HLA
• Reordenamientos genéticos
• Detección de esperma aneuploide
• Creación de mapas genéticos

 

Diagnóstico Microbiológico

·        Diagnóstico rápido de infecciones víricas

·        Detección de microorganismos en células infectadas/transformadas

·        Determinación de la relación génetica entre varios tipos de microorganismos similares

·        Correlacionar la presencia/expresión de agentes virales/infecciosos en tejidos

         neoplásicos.

·        Determinar la resistencia a los antibióticos de las bacterias.

·        Epidemiología de las infecciones

·        Detectar y cuantificar microorganismos difíciles de cultivar o para los que no existen

           reactivos serológicos.

·        Detectar regiones transformantes específicas en virus

 

 

Diagnóstico y clasificación de neoplasias y establecimiento de un pronóstico

·       Detectar reordenamientos de genes

·       Detectar reordenamientos en tumores humanos con anomalías consistentes cariotípicas

·       Detectar reordenamientos moleculares/anomalías de expresión genética en ausencia de alteraciones del cariotipo  

·        Estudio de la estructura/expresión de oncogenes

·        Detección de amplificación genética/resistencia a drogas

·        Diagnóstico de cell lineage en base a la expresión genética 

APLICACIONES PCR

La extraordinaria sensibilidad de la técnica de PCR, que permite detectar una copia viral en un millón de células es un arma de gran valor en la detección de infecciones HPV, especialmente en aquellas con un bajo número de copias víricas, como es el caso de la infección oculta. El problema mas importante de las técnicas de amplificación genómica es la contaminación de la reacción con ADNs extraños, en cualquiera de sus fases, produciendo resultados falsamente positivos. La adopción de medidas, como el uso de pipetas de desplazamiento vertical, de separación de especímenes y reactivos o de "primers" anticontaminación permiten la obtención de resultados fiables. Otra desventaja de la reacción de PCR es la no amplificación de genomas cuando no existen "primers" específicos, con la imposibilidad de detectar nuevos tipos de HPVs.   

La técnica PCR in situ adapta la tecnología habitual de la PCR a un corte histológico. Se puede utilizar un termociclador convencional con alguno "trucos" (3), o bien recurrir a un termociclador específico para PRC in situ .

10.2 TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN.

Hibridación de ácidos nucleicos.

Técnicas de hibridación

Hibridación in situ con filtro (HISF). Este método tampoco precisa de extracción de ADN y analiza muestras obtenidas por raspado o con torunda o cepillo. Las células se aplican directamente sobre un filtro el cual se trata con sustancias alcalinas para la lisis celular y la desnaturalización del ADN.

Hibridación Southern blot (SB). Necesita de la extracción del ADN de la muestra con fenol/cloroformo y de la eliminación de ARN y proteinas de la misma por digestión enzimática. Con la aplicación de endonucleasas de restricción-la enzima Pst I es la mas utilizada, pues corta los genomas de HPVs en fragmentos de diferentes tamaños ofreciendo un patrón característico en el gel de agarosa-el ADN se rompe, realizándose una separación electroforética de los fragmentos en gel de agarosa los cuales pueden ser visualizados con bromuro de etidio.

El blot invertido (BI) es una variante del SB. El ADN celular es marcado e hibridado con con diferentes DNA-HPVs, previamente digeridos y dispuestos en un filtro. El BI requiere una reacción individual para cada especímen, de sensibilidad inferior al SB (detecta 10 copias HPV/célula), se suele utilizar para tipar muchos genotipos en un espécimen.

 El dot/spot blot (DB) consiste en la extracción del ADN celular total y en su desnaturalización, después se fija a una membrana por medio de presión negativa en un aparato manifold.

La hibridación sandwich (HS) no necesita extracción del ADN. Esta técnica utiliza una sonda con dos fragmentos separados, cada uno con una región complementaria con el ácido nucléico diana. Un fragmento se une al filtro y fija la secuencia específica de HPV al mismo.

La hibridación Northern se utiliza para la detcción de RNA  de HPVs. El ARN celular se extrae y se separa por medio de un gel desnaturalizante que contiene formaldehido. Seguidamente se hibridan con sondas ARN antisense o ADN.

Técnica de Southern

Esta técnica fue descrita por el Dr. Southern en 1975 y constituye el método más utilizado para analizar la estructura del ADN cortado por enzimas de restricción. Para la realización de esta técnica se debe extraer ADN genómico de linfocitos de sangre periférica para conocer el genotipo normal del individuo y ADN del tejido tumoral. Con una muestra de 10 cm³ de sangre se pueden extraer de 200 a 300 nanogramos de ADN con lo que se pueden realizar de 20 a 30 "digestiones" con enzimas de restricción.

UNIDAD X TÉCNICAS DE LA

BIOLOGÍA MOLECULAR

10.1  MÉTODOS DE PURIFICACIÓN Y ANÁLISIS DE LOS            

          ÁCIDOS   NUCLEÍCOS.     

La purificación de DNA es un paso clave en la experimentación en Biología Molecular. Los métodos de purificación de DNA se clasifican en dos grandes categorías, según pretendan purificar DNA cromosómico o DNA plasmídico. La purificación de DNA plasmídico es la base de cualquier experimento de clonación molecular. El problema principal que hay que resolver es la separación del DNA plasmídico y DNA cromosómico. En esta práctica hemos elegido el método de “lisis alcalina”, por su simplicidad, bajo coste y reproducibilidad. La purificación de RNA es otro paso clave en la experimentación en Biología Molecular. Cuando se trabaja con células de mamífero existen dos posibilidades: purificar RNA total o mRNA (en base a la cola de palia). La purificación de RNA es la base de la cuantificación de transcritos en estudios de expresión génica. En esta práctica purificaremos RNA mediante el método “TRI-REAGENTTM”. El DNA plasmídico se purificará a partir de bacterias portadoras y el RNA a partir de células humanas cultivadas en el laboratorio. Los ácidos nucleicos se separarán por tamaño mediante electroforesis en geles de agarosa y se visualizarán por irradiación con luz UV en presencia de bromuro de etilio.

Por el contrario, en otros casos el valor diagnóstico se alcanza una vez que el fragmento amplificado se analiza mediante cualquiera de las siguientes técnicas:

1.      Corte con enzimas de restricción. Los fragmentos generados en la restricción se separan en geles de agarosa o poliacrilamida adecuados (Ej. Tipificación HPV, genotipo ApoE).

2.      Hibridación.  Los fragmentos generados en el PCR se separan en  gel de agarosa, se transfieren a un soporte adecuado (nitrocelulosa, nylon), y finalmente se hibridan con un ADN sonda marcado (Ej. Tipificación de los genes HLA Clase II).

3.      Secuenciación.  Los fragmentos generados durante la reacción de secuenciación se separan en geles desnaturalizantes de poliacrilamida (Ej. Secuenciación de genes mitocondriales mutados implicados en ciertas enfermedades).

ü Separación  de ADN de diferente tamaño

v Electroforesis gel

v Poliacrilamida—fragmentos menores de 500 pb

v Marcaje radiactivo (32p) antes de la electroforesis.

Introducción

Se denomina así a todas las técnicas de laboratorio que se usan para aislar ADN o extraerlo en alta pureza, visualizarlo para ver su estado, cortarlo y pegarlo (nacimiento de la Ingeniería genética), amplificar una región en una enorme cantidad de moléculas (clonación de fragmentos en bacterias u otros vectores como virus y PCR), corte de una determinada región con enzimas de restricción para ver si por una mutación se gana o se pierde un sitio de restricción (análisis de mutaciones por RFLP o Restricción fragmentó lengt polymorphism), que siginifica: diferencias en los tamaños de los fragmentos de restricción debido a polimorfismos en el ADN entre otras

Objetivo

·         Conocerá y aplicará las bases moleculares del ADN para su manipulación y en el mejoramiento genético de especies de interés alimenticio, medico y ecológico.

Metodología

Primeramente en eta unidad X para poder aprobarla debemos de subir a la red todos los apuntes realizados en clase, dia por día. Tener en orden todos los trabajos.

Portada

TAREA UNIDAD 8

COMO SE REALIZA EL CONTROL GENETICO DE UN GEN BRCA

El BRCA1 es un gen localizado en el cromosoma 17q21, con herencia autosómica dominante y de alta penetrancia. Está conformado por 5,592 bases, un peso de 207 KDa y estructuralmente formado por 22 exones y 1,863 aminoácidos. Es un gen supresor de tumor, involucrado en la regulación del ciclo celular, reparación del ADN dañado, mantenimiento de la estabilidad genómica y regulación de la transcripción.² Las mutaciones detectadas en este gen son: delaciones, inserciones, mutaciones puntuales, mutaciones sin sentido (codones de detención prematura), hipermetilación de la región promotora.

La mutación del BRCA 1 se da principalmente en grupos étnicos como los judíos Ashkenazi, grupos familiares de Noruega, Islandia, Suecia y Polonia. Dentro de las características sobresalientes en el cáncer de mama asociado a BRCA1 son: edad más temprana, mayor propensión a la multifocalidad y bilateralidad, alto índice mitótico y receptores estrógenos y progestágenos negativos.

Las mutaciones en los genes BRCA-1 y BRCA-2 son asociadas con un subgrupo de los cánceres del seno y de los ovarios. Estos genes tienen funciones diferentes dentro de las células. Así como los otros supresores de tumor, las mutaciones pueden ser heredadas o espontáneas.

Las personas que heredan mutaciones de BRCA-1 o BRCA-2 son más susceptibles al desarrollo del cáncer de los senos.

Los individuos que tienen una mutación BRCA corren un riesgo de desarrollar cáncer de los senos a un 80% (si viven a la edad de 85). El riesgo de desarrollar cáncer de los ovarios es 10-20% para las mutaciones BRCA-2 y 40-60% para las mutaciones BRCA-1. La presencia de estas mutaciones también puede aumentar el riesgo de cáncer de la próstata, del páncreas, del colon, y otros cánceres. El riesgo total de cualquier persona depende de los factores de riesgo genético y ambiental a los cuales se encuentran expuestos. Se estima que las mutaciones en BRCA-1 y BRCA-2 son asociadas con el 5-10% de todos los cánceres de los senos.

Estas mutaciones diferentes se pueden localizar dentro del mismo gen pero en diferentes localizaciones (heterogeneidad de locus) o en diferentes genes por completo (heterogeneidad alélica). Por ejemplo, la susceptibilidad al cáncer heredado de seno y de ovario tiene heterogeneidad tanto de locus como alélica. Más de 500 mutaciones diferentes han sido identificadas que pueden ocurrir en el gen BRCA1 en el cromosoma 17 y aumentar el riesgo de una mujer de desarrollar cáncer del seno. Y más de 300 mutaciones dispersas por todo el gen BRCA2 en el cromosoma 13 están asociadas con la susceptibilidad al cáncer heredado de seno y de ovario.

   

  El Efecto de BRCA en la Sobrevivencia

Ya han existido varios estudios diseñados para determinar las diferencias en la sobrevivencia entre los individuos con cáncer que cargan la mutación BRCA y aquellos quienes desarrollan cáncer espontáneamente. Los resultados son algo contradictorios, posiblemente debido a las diferencias en el diseño del estudio y los factores tales como la definición de los controles (casos espontáneos) y los cargadores. Sin embargo, aunque los individuos que cargan la mutación BRCA tienen un peor pronóstico basado en las características de su cáncer, ellos parecen tener una tasa de sobrevivencia igual o mayor comparada con los pacientes de casos espontáneos. Se piensa que esto se debe a la respuesta de los tumores a la quimioterapia. La mayor susceptibilidad puede ser, en parte, por su mayor ritmo de proliferación. Los tumores también son más susceptibles a los tratamientos contra el cáncer tales como la radiación gamma, cisplatino, y mitomicina C porque estos tratamientos causan daños al ADN que normalmente serían reparadas por los productos BRCA funcionales. Si los genes BRCA están desactivados, la célula no puede reparar el ADN eficientemente y la célula muere. Las células no cancerosas en un individuo con mutación BRCA retienen una copia funcional del gen y pueden entonces reparar su ADN.

Sin embargo, un nuevo estudio indica que el gen está implicado asimismo en un proceso que no está relacionado con el cáncer. En "Cell" científicos del Dana-Farber Cancer Institute de Boston (Estados Unidos) explican que el BRCA1 desempeña un papel en cómo se expresa la información genética de la mujer.

Dado que las mujeres tienen dos cromosomas X, pero sólo uno de ellos está activado. En el nuevo estudio, los autores observaron que un defecto en el BRCA1 puede conducir a una alteración en la inactivación de uno de los cromosomas X en la mujer. Además, comprobaron que si se inhibe la función del BRCA1 normal, aumentan las probabilidades de que un gen localizado en el cromosoma X inactivado se active.

En opinión de los investigadores, el efecto de tener uno o dos cromosomas X funcionales se desconoce. Es algo que califican de "situación biológica inusual", aunque sugieren que las células que contienen dos cromosomas X activados tendrán más probabilidades de contener mayor número de genes expresados, escenario que tal vez estimule el crecimiento de células mamarias tumorales.

BIBLIOGRAFIA

ü http://www.cancerquest.org/index.cfm?page=341&lang=spanish

ü  http://www.cancerquest.org/index.cfm?lang=spanish&page=347

ü  http://www.intramed.net/contenidover.asp?contenidoID=21664

ü  Dana-Farber Cancer Institutehttp://www.dfci.harvard.edu/Cellhttp://www.cell.com/

BIBLIOGRAFIA

·         Watson JD, Tooze J, Kurtz DT. ADN recombinante. Introducción a la ingeniería genética. Ed. Labor.

        1988

·         AGUERO M. E., A. G. Deluca, K. N. Timmis, F. C. Cabello. 1984. A Plasmid-encoded Outer Membran  Protein TraT, Enhances Resistance of Escherichia coli to Phagocytosis.                                                                                                                              Infect. Immun. 46: 740-746.  

·         Murray PR. Baron EJ. Jorgensen JH. Pfaller MA. Yolken RH Editors. Manual of Clínica Microbiology. 8th.

           Ed. Washington, D.C. ASM Press. 2003.

·         http://pathmicro.med.sc.edu/mayer/trans-9.jpg

·         http://www.revista.unam.mx/vol.7/num11/art89/int89.htm

CONCLUSION

Llegamos a la conclusión que en esta unidad 9 transferencias del material genético, afirmamos que si se cumplió con el objetivo ya planteado logramos entender las bases moleculares que existen en el intercambio del material genético entre los diferentes seres vivos.

 Y para ello existen diferentes mecanismos del intercambio del material genético como primero  método natural en los que podemos encontrar l transformación que es solo es la transferencia genética que resulta de la incorporación de DNA desnudo por una célula receptora desde una célula donadora. Y otro de los mecanismos importantes son el de la conjugación que  es la transferencia de DNA de una donadora a una receptora, mediante contacto físico directo entre las células. También la transducción es la transferencia de información genética desde un donador a un receptor y está mediada por un bacteriófago (fago).

El otro mecanismos importantes son los artificiales  son los físicos, y este se clasifica en dos métodos que son microinyeccion y electroporacion que estos dos se refieren a diferente cosa y el segundo el método artificial que son los químicos existen varios métodos muy importantes  el intercambio del material genético.

9.2 Mecanismos de transferencia artificial:

9.2.1 Físicos

Los métodos físicos utilizan técnicas como la microinyección con una fina aguja de cristal y la electroporación (exposición de las células aun choque eléctrico).

            La microinyección resulta ser una técnica muy potente y eficaz, ya que 1 de cada 5 células consigue incorporar el DNA foráneo de forma permanente. El problema de esta técnica es que exclusivamente se puede inyectar una célula cada vez, y por tanto no es el más recomendable para una terapia médica debido a que es demasiado laboriosa como para obtener un número de células indicadas (suficientes, aproximadamente un millar o más) para que el tratamiento tenga éxito.

Es una técnica muy efectiva aunque laboriosa. Es el método que se emplea en la introducción del DNA recombinante en las células embrionarias en el proceso de obtención de animales transgénicos

La electroporación es una técnica que crea o que dota a la membrana de cierta permeabilidad al DNA durante unos pocos segundos debido a una descarga eléctrica. Si la célula o grupo de células sometidas, a dicho choque eléctrico están sumergidos en un medio rico en plásmidos, alguno de ellos puede penetrar en una célula. El problema que suscita este método es que los choques eléctricos no pueden producir los efectos deseados en algunas células y dañarlas o matarlas debido a esta causa.

9.2.2 Químicos

Los vectores sintéticos (han tenido una alta eficacia in vitro, pero una baja in vivo) son de producción sencilla, altamente estables, y se pueden conseguir grandes construcciones.

            Método del fosfato cálcico. Basado en la obtención de un precipitado entre el cloruro de calcio y el DNA en una solución salina de fosfatos. En esta situación co-precipitan formando unos agregados que son endocitados/fagocitados por las células. Aparentemente el agregado con calcio protege al DNA de la degradación por las nucleasas celulares. El tamaño y la calidad del precipitado es crítico para el éxito del proceso, que se ve afectado por factores tales como pequeños cambios en el pH de la solución, etc.

            Método del DEAE dextrano. Basado en la obtención de complejos entre la resina DEAE y el DNA. Los polímeros de DEAE dextrano o polybreno tienen una carga que les permite unirse a las muy negativamente cargadas moléculas de DNA. El DNA acomplejado se introduce en las células mediante choque osmótico mediante DMSO o glicerol. El uso de DEAE dextrano se limita a las transfecciones transigentes. 

            Método DNA desnudo. El DNA desnudo (técnica en fase altamente experimental) es incapaz de entrar en una célula y aún consiguiendo entrar en ellas es rápidamente degradado. La línea de investigación busca incorporar esas secuencias de DNA a un transportador, que le encierra y le lleva hasta la célula Diana en dónde a través de interacciones de membrana se asocia con ella para entregar el material al interior.
  Los problemas que encontramos son que el DNA (rico en cargas -) por ser estructura polar  tiene muchas dificultades para cruzar la membrana plasmática. Además el DNA codificante para  1 gen es aproximadamente de 10 kb, esto representa la longitud aproximada de una célula, en el caso de encontrar el DNA sin ningún tipo de compactación.

            Método Péptidos fusiogénicos Los  péptidos fusiogénicos surgen en una línea de trabajo que nos permita paliar aquellas características del DNA desnudo que nos impiden la entrada.

Des del citoplasma, ahora se tiene que dar la entrada al núcleo, este proceso queda detenido por la envoltura nuclear, con la que el vector sólo puede entrar al núcleo en división, cuando se desorganiza la envoltura nuclear. La envoltura sólo deja pasar por difusión moléculas inferiores a los 9 nanómetros, aunque mediante los transportadores de reconocimiento de la Señal de localización nuclear, podrían entrar moléculas de entre 9-25 nm (los transportadores sintéticos actuales miden más de 25 nm). Lo que nos implica otra nueva dificultad.

9.1.1Transfección.

Se define la transfección como la infección de una célula hospedadora mediante ADN obtenido de un virus. El ADN del virus así introducido, al expresar su programa genético en la célula, termina desencadenando la producción de nuevas partículas de virus dentro, que al igual que en la infección “clásica” por virus completos, conduce a la muerte y lisis de la célula, con la liberación de la progenie de nuevos viriones. Las características de unión de ADN y entrada dependerán del sistema de células competentes que se esté empleando, mientras que el resultado de la transfección depende (al igual que en los ciclos líticos naturales de los virus) del programa del virus en cuestión.

9.1.4 Recombinación.

 La existencia de esta transferencia se infiere a partir de la aparición de recombinantes entre los descendientes del cruzamiento. Sin embargo antes de que aparezca un recombinante estable, los genes trasferidos deben integrarse o incorporarse en el genomio de la célula recipiente mediante un mecanismo de intercambio. Ahora veremos las características de este intercambio.

El intercambio en procariotas no ocurre entre dos genomios completos (como en eucariotas) sino si no entre un genomio completo llamado endogenote (el de la célula F-), y otro incompleto del donante llamado exogenote. De hecho lo que se obtiene en un diploide parcial o merocigoto.

Un solo hecho de recombinación no seria útil para generar recombinantes viables, por que el círculo se rompería y formaría un cromosoma lineal extraña, parcialmente diploide.

Para mantener intacto el círculo debe producirse par de cruzamientos. el fragmento producido se pierde durante el crecimiento celular. Por tanto no sobreviven los dos recíprocos de la recombinación, sino uno solo de ellos.

La recombinación en virus se descubrió por Delbrück, Bailey y Hershey en 1946. Este hallazgo fue posible a la existencia de variabilidad originada por mutación en caracteres de los virus fácilmente observables en los medios de cultivo. Dentro de este tipo de mutaciones están los caracteres de placa, el rango de hospedador, la sensibilidad a la temperatura, etc..). Entre los caracteres de placa que se pueden analizar están la morfología de las calvas o halos de lisis que producen los virus al matar a las bacterias de cultivo en césped.

9.1.1Transducción.

Cuando una célula es atacada por un virus bacteriófago, la bacteria genera nuevas copias del ADN vírico. En la fase de ensamblaje se pueden introducir fragmentos de ADN bacteriano en la cápsida del virus. Los nuevos virus ensamblados infectarán nuevas células.

 

Mediante este mecanismo, una célula podrá recibir ADN de otra bacteria e incorporar nueva información.

Los bacteriófagos son virus que parasitan bacterias. Tienen una estructura compleja formada por una cabeza, que contiene el material genético, y una cola que consta de unas fibras con las que se anclan a la superficie bacteriana. El material genético del bacteriófago pasa desde la cabeza, a través de la cola, hasta el interior de la bacteria.

El material genético del virus se integra dentro del material genético bacteriano y se replica. De esta manera el virus se reproduce y forma nuevos bacteriófagos que acaban provocando que la bacteria se destruya y estalle.

9.1.1Conjugación.

Este proceso se lleva a cabo si la célula presenta el plásmido F, que contiene la información genética para formar pili, puentes que sirven de unión citoplásmica entre dos bacterias. La célula que presenta el plásmido se denomina F+; la célula que no lo contiene se llama F-. La bacteria F+ (donadora de información) se une a una bacteria F- (receptora) mediante uno de su Pili.

A través de él introduce una hebra del plásmido F, de forma que la bacteria F- se convierte en bacteria F+. En ocasiones el plásmido se introduce en el anillo del ADN bacteriano. Entonces, la bacteria donadora se denomina Hfr (High frequency of recombination). De esta forma la bacteria Hfr puede donar a otras células cualquier gen de su ADN.