9.2
Mecanismos de transferencia artificial:
9.2.1
Físicos
Los métodos físicos utilizan técnicas
como la microinyección con una fina aguja de cristal y la electroporación
(exposición de las células aun choque eléctrico).
La microinyección resulta ser una técnica muy potente y
eficaz, ya que 1 de cada 5 células consigue incorporar el DNA foráneo de forma
permanente. El problema de esta técnica es que exclusivamente se puede inyectar
una célula cada vez, y por tanto no es el más recomendable para una terapia
médica debido a que es demasiado laboriosa como para obtener un número de
células indicadas (suficientes, aproximadamente un millar o más) para que el
tratamiento tenga éxito.
Es una técnica muy efectiva aunque
laboriosa. Es el método que se emplea en la introducción del DNA recombinante
en las células embrionarias en el proceso de obtención de animales
transgénicos
La electroporación es una técnica que crea o
que dota a la membrana de cierta permeabilidad al DNA durante unos pocos
segundos debido a una descarga eléctrica. Si la célula o grupo de células
sometidas, a dicho choque eléctrico están sumergidos en un medio rico en plásmidos,
alguno de ellos puede penetrar en una célula. El problema que suscita este
método es que los choques eléctricos no pueden producir los efectos deseados en
algunas células y dañarlas o matarlas debido a esta causa.
9.2.2
Químicos
Los vectores sintéticos (han tenido una alta
eficacia in vitro, pero una baja in vivo) son de producción sencilla, altamente
estables, y se pueden conseguir grandes construcciones.
Método del fosfato cálcico. Basado en la obtención de un
precipitado entre el cloruro de calcio y el DNA en una solución salina de
fosfatos. En esta situación co-precipitan formando unos agregados que son
endocitados/fagocitados por las células. Aparentemente el agregado con calcio
protege al DNA de la degradación por las nucleasas celulares. El tamaño y la
calidad del precipitado es crítico para el éxito del proceso, que se ve
afectado por factores tales como pequeños cambios en el pH de la solución, etc.
Método del DEAE dextrano. Basado en la obtención de complejos
entre la resina DEAE y el DNA. Los polímeros de DEAE dextrano o polybreno
tienen una carga que les permite unirse a las muy negativamente cargadas
moléculas de DNA. El DNA acomplejado se introduce en las células mediante
choque osmótico mediante DMSO o glicerol. El uso de DEAE dextrano se limita a
las transfecciones transigentes.
Método DNA desnudo. El DNA desnudo (técnica en fase
altamente experimental) es incapaz de entrar en una célula y aún consiguiendo
entrar en ellas es rápidamente degradado. La línea de investigación busca
incorporar esas secuencias de DNA a un transportador, que le encierra y le
lleva hasta la célula Diana en dónde a través de interacciones de membrana se
asocia con ella para entregar el material al interior.
Los problemas que encontramos son que el DNA (rico en cargas -) por ser
estructura polar tiene muchas dificultades para cruzar la membrana
plasmática. Además el DNA codificante para 1 gen es aproximadamente de 10
kb, esto representa la longitud aproximada de una célula, en el caso de encontrar
el DNA sin ningún tipo de compactación.
Método Péptidos fusiogénicos Los péptidos fusiogénicos surgen en una línea de trabajo que nos
permita paliar aquellas características del DNA desnudo que nos impiden la
entrada.
Des del citoplasma, ahora se tiene que
dar la entrada al núcleo, este proceso queda detenido por la envoltura nuclear,
con la que el vector sólo puede entrar al núcleo en división, cuando se
desorganiza la envoltura nuclear. La envoltura sólo deja pasar por difusión
moléculas inferiores a los 9 nanómetros, aunque mediante los transportadores de
reconocimiento de la Señal de localización nuclear, podrían entrar moléculas de
entre 9-25 nm (los transportadores sintéticos actuales miden más de 25 nm). Lo
que nos implica otra nueva dificultad.
