10.3 TÉCNICA DE CLONACIÓN DE GENES

Una clona es definida como un gran numero de células o moléculas todas idénticas provenientes de un origen único Clonación del DNA ha sido posible por: Enzimas de restricción.  La capacidad de los vectores de clonación de multiplicarse después  que DNA ha sido insertada en su genoma.

Clonación del DNA

Es la inserción de DNA en un vector de clonación y luego este vector con el DNA debe ser introducido en bacterias o levaduras u otra célula hospedera.

Clonación require:

A. DNA Blanco:

PCR: Primers específicos y purificar el fragmento amplificado

RT-PCR: cDNA y luego primers específicos y purificar el fragmento amplificado.

B. Vectores de Clonación-Expresión: Elementos

Plásmidos, cosmidos, fagos, Bac, Yac, etc.

C. Célula hospedera:

E. coli, levaduras, Células de insectos.

D. Métodos de transformación:

Inefectividad.

Cloruro de calcio, cloruro de litio, liposomas, etc.

Electroporacion, balistica o shot gun.

Método de tamizaje de la presencia del inserto.

- Inicialmente, que la bacetria crezca en presencia del marcador de selección.

- Cambio de coloración de la colonia bacteriana.

- PCR

- Miniprep y digestión con enzimas de restricción.

- Hibridización con una sonda

- Evaluando la expresión o actividad de la proteína.