UNIDAD X TÉCNICAS DE LA

BIOLOGÍA MOLECULAR

10.1  MÉTODOS DE PURIFICACIÓN Y ANÁLISIS DE LOS            

          ÁCIDOS   NUCLEÍCOS.     

La purificación de DNA es un paso clave en la experimentación en Biología Molecular. Los métodos de purificación de DNA se clasifican en dos grandes categorías, según pretendan purificar DNA cromosómico o DNA plasmídico. La purificación de DNA plasmídico es la base de cualquier experimento de clonación molecular. El problema principal que hay que resolver es la separación del DNA plasmídico y DNA cromosómico. En esta práctica hemos elegido el método de “lisis alcalina”, por su simplicidad, bajo coste y reproducibilidad. La purificación de RNA es otro paso clave en la experimentación en Biología Molecular. Cuando se trabaja con células de mamífero existen dos posibilidades: purificar RNA total o mRNA (en base a la cola de palia). La purificación de RNA es la base de la cuantificación de transcritos en estudios de expresión génica. En esta práctica purificaremos RNA mediante el método “TRI-REAGENTTM”. El DNA plasmídico se purificará a partir de bacterias portadoras y el RNA a partir de células humanas cultivadas en el laboratorio. Los ácidos nucleicos se separarán por tamaño mediante electroforesis en geles de agarosa y se visualizarán por irradiación con luz UV en presencia de bromuro de etilio.

Por el contrario, en otros casos el valor diagnóstico se alcanza una vez que el fragmento amplificado se analiza mediante cualquiera de las siguientes técnicas:

1.      Corte con enzimas de restricción. Los fragmentos generados en la restricción se separan en geles de agarosa o poliacrilamida adecuados (Ej. Tipificación HPV, genotipo ApoE).

2.      Hibridación.  Los fragmentos generados en el PCR se separan en  gel de agarosa, se transfieren a un soporte adecuado (nitrocelulosa, nylon), y finalmente se hibridan con un ADN sonda marcado (Ej. Tipificación de los genes HLA Clase II).

3.      Secuenciación.  Los fragmentos generados durante la reacción de secuenciación se separan en geles desnaturalizantes de poliacrilamida (Ej. Secuenciación de genes mitocondriales mutados implicados en ciertas enfermedades).

ü Separación  de ADN de diferente tamaño

v Electroforesis gel

v Poliacrilamida—fragmentos menores de 500 pb

v Marcaje radiactivo (32p) antes de la electroforesis.